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      關于熒光定量PCR,你想要了解的都在這里了!

      發布時間:2019-11-01 閱讀:1029

      熒光定量PCR,是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術,它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程,結合相應的軟件可以對產物進行分析,計算待測樣品模板的初始濃度。

       

      一、原理

      PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;剛開始時, 探針結合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步?;蛘呤褂脽晒馊玖?/span>SYBR。SYBR可以結合到雙鏈DNA上面,當體系中的模板被擴增時,SYBR可以有效結合到新合成的雙鏈上面,隨著PCR的進行,結合的SYBR染料越來越多,被儀器檢測到的熒光信號越來越強,從而達到定量的目的。

       

      二、應用領域

      臨床疾病診斷:各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價;地中海貧血、血友病、性別發育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優生優育檢測;腫瘤標志物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷;遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。

      動物疾病檢測:禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。

      食品安全:食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業阪崎腸桿菌等檢測。

      科學研究:醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。

      應用行業:各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。

       

      三、熒光定量PCR前景展望

      實時熒光定量PCR的出現,大地簡化了定量檢測的過程,而且真正實現了定量。多種檢測系統的出現,使實驗的選擇性強。自動化操作提高了工作效率,反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰。隨著生物芯片技術和熒光探針定量技術的結合,熒光定量PCR在醫學檢測及其他各個領域中的應用前景將加廣闊,令人欣喜。盡管如此我們也應清晰認識到,FQ-PCR技術在我國各個研究領域的應用并不多見,這就需要我國學者迎頭趕上,使FQ-PCR技術充分地推廣,以推動研究工作的快速發展。

       

      四、熒光定量PCR實驗操作步驟

      (一、)熒光定量PCR樣品RNA的抽提

      ①取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其完全溶解。

      ②兩相分離 每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,1530℃孵育23分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

      RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后1530℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

      RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀?;靹蚝?,4℃下7000rpm離心5分鐘。

      RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

      ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次,使其完全溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

      (二)熒光定量PCRRNA質量檢測

      1)紫外吸收法測定

      先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計260nm280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。

      ① 濃度測定

      A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為:A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下:

      RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀釋至495μlTE中,測得A260 = 0.21

      RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 0.84 μg/μl

      5ul用來測量以后,剩余樣品RNA35 μl,剩余RNA總量為:

      35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

      ②純度檢測

      RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.82.1。

      2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定

      ①制膠

      1g瓊脂糖溶于72ml水中,冷卻至60℃,10 ml10× MOPS電泳緩沖液和18 ml37% 甲醛溶液(12.3 M)。

      10×MOPS電泳緩沖液

      濃度 成分

      0.4M MOPS,pH 7.0

      0.1M 乙酸鈉

      0.01M EDTA

      灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內,加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

      ②準備RNA樣品

      3μgRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

      ③電泳

      上樣前凝膠須預電泳5min,隨后將樣品加入上樣孔。56V/cm電壓下2h,電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少23cm。

      ④紫外透射光下觀察并拍照

      28S18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個小稍微擴散的帶,它由低分子量的RNAtRNA5S核糖體RNA)組成。在18S28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質,可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現,即高分子量的彌散遷移物質或者帶,RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

      (三、)熒光定量PCR樣品cDNA合成

      ①混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,取出后立即冰水浴至管內外溫度一致,然后加逆轉錄酶0.5μl,37℃水浴60分鐘。

      ③取出后立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液,保存于-80℃待用。

      (四)熒光定量PCR樣品

      管家基因(β-actin)實時定量PCR

      ①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011,反應前取3μl10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。

      ②制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機,反應條件為:932分鐘,然后931分鐘,552分鐘,共40個循環。

      (五)熒光定量PCR模板

      ①針對每一需要測量的基因,選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。

      PCR產物與 DNA Ladder2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

      ③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

      (六)熒光定量PCRPCR

      ①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。

      ②將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為:932分鐘預變性,然后按931分鐘,551分鐘,721分鐘,共40個循環,后727分鐘延伸。

         (七)熒光定量PCR引物列表

      引物設計軟件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構;引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(。

      (八)熒光定量PCR電泳

      各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView染色,檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

       



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